عزل انتشار الحيوانات المنوية المتحركة باستخدام أغشية كهربية متوافقة بيولوجيا

مكونات

تم شراء بولي (ε-caprolactone) (MW = 80 كيلو دالتون) ، كلوروفورم من الدرجة AR ، ميثانول درجة HPLC ، هيدروكسيد الصوديوم ، ملح فوسفات عازل مخلوط مسبقًا عند درجة الحموضة = 7.4 وألبومين مصل الأبقار تم شراؤها من Sigma Aldrich (أستراليا). تم الحصول على عينات الحيوانات المنوية من الثور من أجل علم الوراثة الحيوانية الكلية (أستراليا). تمت طباعة الوحدات ثلاثية الأبعاد باستخدام طابعة Brusa I3MK2S الأصلية مع ألياف بولي (حمض اللاكتيك) (PLA) من Brusa Research (جمهورية التشيك).

تشكيل وتوصيف أغشية PCL

تم تحقيق الغزل الكهربائي لأغشية PCL في HOLMARC HO-NFES-043U (كالاماسري ، ولاية كيرالا ، الهند). تم عمل المحلول عن طريق صوتنة بتركيزات مختلفة (7.1 ، 10.2 و 11.7٪ بالوزن) من أغشية PCL للغزل الكهربائي عن طريق إذابة الوزن المناسب لجزيئات PCL في 25٪ ميثانول في الكلوروفورم. تم تداول محاليل PCL باستخدام حقنة 5.0 مل وإبرة قياس 18 بمعدل تدفق 25 ، C ، 11 كيلو فولت ، 1 مل / ساعة بمعدل تدفق 12 سم من طرف الإبرة إلى مجمع المغزل بسرعة 800 دورة في الدقيقة لمدة 90 دقيقة.

تم الحصول على صور المجهر الإلكتروني الماسح عند 5 كيلو فولت باستخدام Geol Nioscope JCM 5000 (اليابان). قبل تصوير SEM ، كانت الأغشية مغلفة بجزيئات ذهب 5 نانومتر باستخدام طبقة رشاش BAL-TEC SCD 050 (Leica Microsystems ، أستراليا). تم تقدير أقطار الفتحة البالغة 20 مترًا من الأغشية السميكة باستخدام مقياس التدفق الشعري (3G Zh Quantachrome ، فلوريدا ، الولايات المتحدة الأمريكية) بضغوط تتراوح بين 0.04186 و 0.1674 بار. تم حساب قطر الألياف باستخدام imageJ.

تحديد تركيز الحيوانات المنوية

تم إذابة عينات الحيوانات المنوية المجمدة عند 37 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة وتم تخفيفها في محلول مائي 3 ٪ (وزن / حجم) من كلوريد الصوديوم كما هو موضح في الجدول 2. تم قياس الامتصاص عند 280 نانومتر لجميع محاليل النسخ المتماثل ثلاث مرات باستخدام الأشعة فوق البنفسجية. تم حساب متوسط ​​مقياس الطيف الضوئي المرئي (NanoDrop 2000C ، ThermoFisher Scientific ، الولايات المتحدة الأمريكية) وكل نسخة. العدد الإجمالي لنسخ العينة ن= 6.

للكشف عن تركيز الحيوانات المنوية ، تم تخفيف 10 ميكرولتر من 10 أضعاف (رقم العينة 1) ووضعها في خلية الدم بارتفاع 0.10 مم ، مما يسمح بترقيم الخلايا تحت معمل زايس أكسيو. A1 متغير المجهر. تم عمل عدد الخلايا مرتين لكل نسخة ، مع العدد الإجمالي ن = 6. لحساب التركيز الأولي لعينة الحيوانات المنوية ، تم استخدام رقم الخلية في العينة رقم 1 ، والذي تم استخدامه للحصول على تركيز الحيوانات المنوية على أساس مليون خلية في المليون في المحلول المخفف اللاحق. استخدم الانحدار الخطي لتحديد العلاقة بين قياسات الامتصاص وتركيز الحيوانات المنوية. ص لحساب عدم وجود الحيوانات المنوية في الامتصاص 0 ، يُجبر التقاطع على 0.

تحديد وقت الحد الأقصى للسبريد

تم تصنيع أغشية PCL باستخدام تركيز أعلى من 10.2٪ بالوزن للاختبارات اللاحقة. يبلغ سمك الغشاء الأولي 20 م. بدلاً من تكوين أغشية أكثر سمكًا ، تم اختيار أغشية أرق لمنع تغيير الهيكل الداخلي بشكل كبير.

تم وضع الأغشية في وحدة مطبوعة ثلاثية الأبعاد ومزودة بـ 2.5 مل 0.3 ٪ (وزن / حجم) من الكوارتز المملوء بـ BSA في محلول PBS المؤقت ، ودرجة الحموضة = 7.4 ومتوازنة عند 37 درجة مئوية قبل التصنيف. تم استخدام مقياس الطيف الضوئي Nanodrop المرئي للأشعة فوق البنفسجية عند 37 درجة مئوية مع ضبط الكشف عن الطول الموجي عند 300 نانومتر لاكتشاف الحيوانات المنوية التي تمتد 900 ثانية أو أكثر. تم حساب الوقت اللازم لتحقيق أقصى انتشار عن طريق حساب التوافق الأمثل والزيادة الثابتة ونقطة الامتصاص بالنسبة للهضبة. X.يقطع كلا المعادلتين.

الإجراء القياسي لعزل الحيوانات المنوية المتحركة

تم إذابة ستة عينات من الحيوانات المنوية المجمدة من ستة ثيران مختلفة لمدة دقيقة واحدة عند 37 درجة مئوية وتم جمعها قبل فرز الحيوانات المنوية. في هذه التجربة ، العدد الإجمالي للأغشية المكررة ن= 6. تم تركيب أغشية Electrospan PCL على حجم مطبوع ثلاثي الأبعاد ، والذي سمح له بالوصول إلى التوازن عند الرقم الهيدروجيني لمحلول ملحي الفوسفات (PBS) 1 مل 0.3 ٪ (وزن / حجم) من ألبومين المصل (BSA) عند 37 درجة مئوية. = 7.

بعد الوصول إلى التوازن ، تم السماح لـ 100 ميكرولتر من عينات الحيوانات المنوية بالتشتت عبر الأنبوب لمدة 30 دقيقة. تمت إزالة الحجم ثم تحليل عينة الحيوانات المنوية عن طريق قياس الامتصاص عند 280 نانومتر وتم حساب عدد الحيوانات المنوية المتحركة عن طريق التقدير تحت مجهر تغير الطور. لعينة فارغة ، تم تخفيف 100 ميكرولتر من السائل المنوي بـ 1 مل من 0.3٪ (وزن / حجم) BSA عند الرقم الهيدروجيني = 7.4 في برنامج تلفزيوني. تم تخفيف العينة الفارغة 100 لتر إلى 0.3٪ (وزن / حجم) BSA عند 100 BSL في pBS عند الرقم الهيدروجيني = 7.4 ، وهو المحلول المستخدم لحساب التركيز الأولي للحيوانات المنوية في عينة الحيوانات المنوية المجمدة عن طريق قياس حجم الامتصاص. وتقدير عدد الحيوانات المنوية المنقولة في المجتمع تحت مجهر تغير الطور. تم إجراء قياسات الامتصاص ثلاث مرات وتكرار عدد الحيوانات المنوية المتحركة ، كل قياس باستخدام مجموع الحيوانات المنوية في خمسة مجالات مختلفة تحت المجهر.

تحليل احصائي

تم تحديد فروق ذات دلالة إحصائية في متوسط ​​النقاء المعزول من خلال تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) والتحليل المقارن المتعدد بواسطة Dukey. تم تحديد الحالة الطبيعية مع Dalal-Wilkinson-Lilly باستخدام اختبار Kolmogorov-Smirnov. باختبار القيمة وقوة براون لسلامة التباين.